Современное использование передовых методов биотехнологии для улучшения качества плодов томата
Введение
Как известно, томат (Solanum lycopersicum) является одной из важнейших овощных культур мира, занимая внушительные площади в открытом и защищенном грунте. Однако, вместе с тем, томат является модельным объектом для изучения генетики растений с сочными плодами. Это привело к тому, что геном томата был полностью секвенирован и многие из его генов были функционально аннотированы. Вместе с тем, в отличие от большинства сельскохозяйственных растений, которые имеют, в силу продолжительного культивирования человеком, обедненный генофонд, томат обладает огромным генетическим разнообразием, сосредоточенным в его дикорастущих родственных видах. С диетической точки зрения томат является важным компонентом рациона человека с круглогодичным потреблением, в то время как продовольственная безопасность является важной глобальной проблемой и требует увеличения производства продуктов питания в связи с постоянным ростом населения и изменениями климата. В то же время общемировое повышение уровня жизни людей ведет к растущему спросу на продукцию с хорошим внешним видом и богатой питательной ценностью. Все это привело к мощному развитию направления по улучшению качества плодов томата при помощи различных подходов в области биотехнологии и молекулярной генетики.
Аннотация
Прошло почти полвека с того момента, как была открыта возможность Ti-плазмиды переносить чужеродную ДНК в геном растений. Это дало мощный толчок к дальнейшим исследованиям и совершенствованию инструментов манипуляциями геномом. Сегодня ученые используют третье поколение технологий редактирования генома, известное как CRISPR. Многие из этих научных работ проводятся на томатах, которые не только являются модельными объектами для изучения генетики растений с сочными плодами, но также играют важную роль в рационе человека. В данной статье мы обсуждаем наиболее значимые результаты применения биотехнологических подходов на растениях томата, делая особый акцент на улучшении качества плодов.
В понятие улучшенного качества плодов входит множество показателей, основными из которых являются: повышенная питательная ценность, внешний вид, масса плода, его транспортабельность и лежкость.
Возможность изменять и улучшать эти показатели была достигнута при появлении новых подходов в области молекулярной генетики и биотехнологии. Молекулярные подходы при помощи маркер-ориентированной и геномной селекции мы уже подробно обсуждали в предыдущих статьях. Поэтому теперь рассмотрим эволюцию методов биотехнологии.
Как известно, томат является одной из важнейших овощных культур мира, занимая внушительные площади в открытом и защищенном грунте. Вместе с тем, томат является модельным объектом для изучения генетики растений с сочными плодами. Это привело к тому, что геном томата был полностью секвенирован, и многие из его генов были функционально аннотированы.
Основными биотехнологическими подходами для улучшения качества плодов томата являются: сверхэкспрессия генов, РНК интерференция или сайленсинг генов и геномное редактирование. Историческим прорывом в области биотехнологии растений стал 1978 год, когда Ti-плазмиды из Agrobacterium tumefaciens впервые были идентифицированы как структуры, участвующие в переносе ДНК в растения. В 1987 году последовательности CRISPR были обнаружены в геноме бактерии (Escherichia coli). Генная инженерия вышла в область прикладной науки, начиная с 1993 года, когда в США был выпущен на рынок первый трансгенный томат, созданный при помощи антисмысловой РНК. Чуть позже, в 1998 году, была присуждена Нобелевская премия за открытие РНК-интерференции как нового инструмента в биотехнологии. И в 2013 году, с полномасштабным развитием технологии геномного редактирования CRISPR, ученые получили возможность совершать прежде недоступные манипуляции с геномом, что положило начало череде блистательных работ в фундаментальной и прикладной науке. Сегодня конструкции на базе CRISPR позволяют программируемо совершать нокдаун генов, осуществлять вставку заданной последовательности ДНК в геном, и точечно менять нуклеотиды в определенных участках ДНК.
Научная ценность сверхэкспрессии генов состоит в том, что с помощью данного подхода ученые получили возможность осуществлять повышенную наработку целевого белка, определяя его влияние на тот или иной процесс, протекающий в клетках.
Для этого интересующий ген ставят под инородный конститутивный промотор. К одному из наиболее используемых в томате промоторов подобной функциональности можно отнести промотор вируса мозаики капусты. Промоторы, запускающие ген в транскрипцию начальной стадии процесса по превращению последовательности ДНК в белок, могут быть разных типов, предоставляя дополнительную гибкость данной технологии. Конститутивные промоторы работают всегда и во всех клетках, обеспечивая постоянный уровень транскрипции гена. Тканеспецифичные промоторы работают только в определенных клетках растения как специфичный для плодов промотор 2A11. Индуцибельные промоторы начинают работать в ответ на определенные стимулы, как, например, индуцируемый промотор липазы 9 (Lip9). При этом сами генно-инженерные подходы делятся на трансгеноз, когда гены передаются из других видов, и цисгеноз, когда гены передаются от родственных видов, с которыми возможно скрещивание. В области повышения качества плодов путем сверхэкспрессии генов главным образом применяется трансгеноз. К примеру, трансгенные линии томата, гетерологично экспрессирующие гены биосинтеза глицинабетаина (GB), codA из Arthrobacter globiformis и BADH из шпината (Spinacia oleracea L.), продемонстрировали образование более крупных и тяжелых плодов. С целью снижения послеуборочных потерь был проведен трансгеноз ликопиновой β-циклазы (LCYb) из арабидопсиса в растение томата. В результате, трансформированные растения показали увеличение β-каротина в плодах и продленный срок хранения. Твердость плодов в таких LCYb-сверхэкспрессирующих линиях была обусловлена более высоким накоплением абсцизовой кислоты в результате повышенной продукции β-каротина, значительным снижением этилена и эвапотранспирации, а также повышенным уровнем общего материала клеточных стенок и толщины кутикулы у трансгенных плодов.
Особое внимание ученых было обращено к метаболизму этилена, который отвечает за созревание типичных климактерических плодов томата. Известно, что полиамины являются антагонистами этилена. Экзогенное применение полиаминов увеличивает срок хранения и текстуру плодов за счет подавления накопления этилена, активности дыхания и быстрого изменения окраски. В недавней работе ученые показали, что высокая экспрессия гена аргининдекарбоксилазы овса (AsADC), участвующего в пути биосинтеза полиаминов, у модифицированных растений томата продлевает срок хранения в результате повышенного биосинтеза полиаминов, таких как спермидин, спермин и путресцин, в свою очередь изменяющих экспрессию генов SlyXTH5, SlyEXP1 и SlyTBG4, связанных с созреванием. Кроме того, сверхэкспрессия AsADC привела к повышенному накоплению в плодах таких важных нутриентов как аскорбиновая кислота, антиоксиданты, ликопен и растворимый сахар, указывая на одновременное улучшение органолептических свойств трансформированных плодов. Также роль полиаминов в увеличении срока годности плодов томата и улучшении органолептических свойств отмечена в работе по сверхэкспрессии гена S-аденозилметиониндекарбоксилазы человека (h-SAMDC) и орнитиндекарбоксилазы мыши (m-ODC), участвующих в биосинтезе полиаминов, специфичным для плодов способом. Кроме воздействия на биосинтез полиаминов и каротиноидов было обнаружено, что белки Polycomb-group (PcG) участвуют в эпигенетических модуляциях, связанных с повышением качества текстуры плодов и их срока хранения. Это доказывает работа, в ходе которой сверхэкспрессия гена MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1 (SlMSI1), кодирующего белок Polycomb-группы (PcG), показала повышение вышеописанных характеристик у плодов трансформированных плодов томата.
Повышение питательной ценности является отдельным обширным направлением улучшения качества плодов томата. В первую очередь это связано с контролем биосинтеза таких полезных для человека соединений как каротиноиды и флавоноиды. Поэтому гены, вовлеченные в биосинтез данных веществ, были активно использованы в качестве мишеней для генной инженерии.
Известно, что ген фитоенсинтазы-1 (PSY1) кодирует фермент, катализирующий превращение GGDP в фитоен в пути биосинтеза каротиноидов. Сверхэкспрессия PSY1, управляемая конститутивным промотором CaMV 35S в томате, ведет к более высокому накоплению каротиноидов в трансгенных плодах. Также, повышение нутриентов в плодах томата было продемонстрировано при сверхэкспрессии конститутивно активного домена GAF Tyr-to-His мутантной формы PHYB2 (PHYB2Y 252H). В результате данного эксперимента было отмечено высокое накопление полезных для здоровья фитонутриентов, включая каротиноиды, флавоноиды, аскорбиновые кислоты и токоферолы, в трансформированных плодах при созревании. Продолжение статьи читайте в следующем номере журнала «ГАВРИШ».
авторы:
М.В. Будылин, к.б.н., заведующий лабораторией молекулярной диагностики «ГАВРИШ», Д.Ю. Тяпкина, к.б.н., А.А. Даниленко, м.н.с.
Литература
1. S.H. Shah, S. Ali, Z. Hussain, S.A. Jan, J.U. Din, G.M. Ali. Genetic improvement of tomato (Solanum lycopersicum) with AtDREB1A gene for cold stress tolerance using optimized Agrobacterium-mediated transformation system. Inter. J. Agri. Biol., 18 (2016), pp. 471-482
2. Xiangyu Ding, Ziyi Yin, Shaoli Wang, Haoqi Liu, Xiaomeng Chu, Jiazong Liu, Haipeng Zhao, Xinyu Wang, Yang Li, Xinhua Ding. Different Fruit-Specific Promoters Drive AtMYB12 Expression to Improve Phenylpropanoid Accumulation in Tomato. Molecules 2022, 27 (1) , 317. https://doi.org/10.3390/molecules27010317.
3. Zhang T, Liang J, Wang M et al (2019) Genetic engineering of the biosynthesis of glycinebetaine enhances the fruit development and size of tomato. Plant Sci 280:355–366. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2018.12.023.
4. Diretto G, Frusciante S, Fabbri C et al (2020) Manipulation of β-carotene levels in tomato fruits results in increased ABA content and extended shelf life. Plant Biotechnol J 18:1185–1199. https://doi.org/10.1111/pbi.13283
5. Gupta A, Pandey R, Sinha R et al (2019) Improvement of post-harvest fruit characteristics in tomato by fruit-specific over-expression of oat arginine decarboxylase gene. Plant Growth Regul 88:61–71. https://doi.org/10.1007/s10725-019-00488-0
6. Madhulatha P, Gupta A, Gupta S (2013) Fruit-specific over-expression of human S-adenosylmethionine decarboxylase gene results in polyamine accumulation and affects diverse aspects of tomato fruit development and quality. J Plant Biochem Biotechnol 23:151–160. https://doi.org/10.1007/s13562-013-0194-x
7. Pandey R, Gupta A, Chowdhary A (2014) Over-expression of mouse ornithine decarboxylase gene under the control of fruit-specific promoter enhances fruit quality in tomato. Plant Mol Biol 87:249–260. https://doi.org/10.1007/s11103-014-0273-y
8. Liu DD, Zhou LJ, Fang MJ et al (2016) Polycomb-group protein SlMSI1 represses the expression of fruit-ripening genes to prolong shelf life in tomato. Sci Rep. https://doi.org/10.1038/srep31806
9. Fray RG, Wallace A, Fraser PD et al (1995) Constitutive expression of a fruit phytoene synthase gene in transgenic tomatoes causes dwarfism by redirecting metabolites from the gibberellin pathway. Plant J 8:693–701. https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.1995.08050693.x
10. Alves FR, Lira BS, Pikart FC, Monteiro SS (2020) Beyond the limits of photoperception: constitutively active PHYTOCHROME B2 overexpression as a means of improving fruit nutritional quality in tomato. Plant Biotechnol J. https://doi.org/10.1111/pbi.13362
