Современные методы идентификации вирусов

Как известно, от вирусов невозможно излечить. Единожды попав в оборот монокультуры, все равно, в открытом или защищенном грунте, некоторые вирусы способны вызывать значительный экономический урон год за годом.

Такая динамика обеспечивается за счет источников распространения вируса и путей его передачи от растения к растению. К примеру, род Ipomovirus передается при помощи насекомых-векторов, таких как белокрылка. В свою очередь род Tobamovirus включает в себя группу вирусов, способных передаваться с семенами и поливной водой, при этом сохраняясь в растительных остатках. Совсем недавно появился новый Tobamovirus томата, известный как Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV). Он способен преодолевать все известные генетические устойчивости и обладает свойственной всем представителям рода способностью передаваться через семена и механическим путем. Учитывая его фитопатогенный потенциал, очень важно отслеживать появление этого вируса в посевах. Появление вирусов имеет очаговый характер. Крайне важно определить, что за вирус оказался на возделываемой культуре, чтобы планировать дальнейшие стратегии купирования его распространения и минимизации ущерба.

В компании «Гавриш» проводится сертификация семян на отсутствие экономически значимых латентных фитопатогенов при помощи ПЦР-анализа. Благодаря этому наши клиенты защищены от появления seed-borne вирусов. Однако когда мы обнаруживаем латентную инфекцию в семенах, данные лоты продукции подлежат уничтожению. Поэтому для нас особенно важно следить за появлением вируса во время периода вегетации, чтобы не допустить массового заражения семян. Мы используем чистый посадочный материал, чтобы обезопасить растения на стадии рассады. Но со временем в посадки растений неизбежно начинают проникать вирусы из окружающей среды, и критически важно своевременно и верно их идентифицировать.

Итак, как действовать, когда в посевах появляется первый очаг инфекции?

В первую очередь проводится идентификация патогена. В отличие от грибов, которые часто вызывают увядание, или же бактерий, которые чаще всего провоцируют гнили, вирусы приводят к нарушению однородной окраски и формы листьев и плодов. Если поражение имеет резкий и массовый характер, вполне возможно, что причиной этого явления служат другие абиотические факторы, например дисбаланс в составе питательного раствора.

Определив, что причина симптомов — вирус, необходимо узнать его род и вид. Визуально сделать это довольно сложно, так как вирусы обладают перемежающимися симптомами, которые зависят от множества факторов, включая условия окружающей среды, штамм, генотип растения-хозяина и даже взаимодействие нескольких вирусов. И тут на помощь растениеводу приходят высокие технологии в области диагностики фитопатогенов. 

Для лабораторного обнаружения наиболее коммерчески важных фитопатогенных вирусов разработаны эффективные методы на основе ИФА и ПЦР. Все эти методы инструментального анализа обладают высокой чувствительностью и производительностью, что делает их пригодными для широкого использования при сертификации посадочного материала и карантинном контроле, а также при мониторинге вирусных инфекций.

Сразу необходимо сказать, что нет рутинного метода определения, какой именно из множества вирусов-кандидатов поразил растения. В особых случаях можно использовать пробу с пораженного растения для последующего секвенирования, которое позволит увидеть, какие РНК присутствуют в образце. Далее биоинформатические подходы позволят сравнить образец с геномами всех доступных фитопатогенов в базе данных и идентифицировать причинный вирус по совпадениям генома. Однако данный подход довольно дорогой, долгий и некоммерциализированный.

В последние годы широкое распространение получил метод диагностики ДНК-микрочипов, обеспечивающий возможность параллельного обнаружения всех патогенов в одном образце тестируемой культуры.

Куда более удобным и рутинным методом диагностики в «поле» служат экспресс-иммунохроматографические тест-полоски на основе коллоидного золота. По такому же принципу работают тесты на Covid-19. Когда тест-полоска погружается в анализируемый образец, жидкость образца протекает через мембраны под действием капиллярных сил и запускает иммунохимические взаимодействия, приводящие к видимому окрашиванию тестовых и контрольных линий. Ряд зарубежных компаний выпускает тест-полоски для обнаружения вирусов растений: Spot Check LF (Adgen Ltd., Великобритания), Pocket Diagnostic (Forsite Diagnostics Ltd., Великобритания) и Immunostrips (Agdia, США). Этот подход позволяет идентифицировать вирус в течение 10 минут. Однако детекция произойдет только в том случае, если в пробе присутствует целевой вирус. Это означает, что если у проявившихся симптомов есть несколько вирусов-кандидатов, придется использовать несколько тест-полосок на разные вирусы.

Мы в компании «Гавриш», для того чтобы определить наличие/отсутствие вируса или же вироида в образце, используем золотой стандарт молекулярной диагностики — метод ПЦР в реальном времени. Данная технология позволяет достоверно определить тот или иной вирус за счет детекции специфического фрагмента генетического кода, который уникален даже для штамма вируса в пределах одного вида. Однако этот метод требует обработки образца в условиях лаборатории.

Еще один диагностический метод определения наличия/отсутствия вируса в растительном образце - иммуноферментный анализ, или ИФА (ELISA). Определение вирусных белков с помощью ЕЕКА традиционно использовалось для количественной оценки распространения вируса в урожае или партии семян. Данный метод, как и иммунохроматографический тест, основан на взаимодействии «антиген - антитело», где специфические антитела взаимодействуют с белками вирусного капсида, приводя к изменениям оптической плотности, которые улавливаются прибором детекции. Однако как и все методы, основанные на антителах, ELISA уступает методу ПЦР в точности результата. Также ELISA неспособен определять штамм вируса, что зачастую является очень важным.

Таким образом, в распоряжении растениевода есть достаточно точных методов видоспецифического определения вирусного патогена для принятия своевременных мер по купированию экспансии вируса на самых ранних стадиях его появления. Мы в компании «Гавриш» из года в год пользуемся современными технологиями молекулярной диагностики, чтобы вовремя искоренить в своих теплицах такие опасные вирусы, как вирус зеленой крапчатой мозаики огурца или же вирус мозаики томата. 

Повторный анализ семенных лотов на наличие латентной инфекции позволяет сертифицировать посадочный материал и гарантировать его чистоту, тем самым поддерживая фермеров в их извечном противостоянии фитовирусам.

Михаил Будылин, к. б. н., заместитель генерального директора по молекулярной диагностике и биотехнологии НИИСОК

Фото Елена Аль-Шимари