Современное использование передовых методов биотехнологии для улучшения качества плодов томата

7 октября 2022

Первая часть статьи опубликована в 4 номере журнала "Гавриш" за 2022 г.

Работы по улучшению качества плодов томата следующего поколения строились на использовании технологии антисмысловой интерферирующей РНК. В отличие от сверхэкспрессии, данный метод основан на посттранскрипционном подавлении генов, также известном как сайленсинг. Другими словами, ген перестает работать, тем самым обнаруживая свою роль в генных и метаболических сетях. Метод РНК интерференции применяется как в фундаментальной науке для определения функции гена, так и в прикладной для получения трансгенных ГМО культур. Одним из первых применений данного метода на томате стало подавление гена полигалактуроназы (PG), который регулирует размягчение клеточной стенки и был использован для первого коммерческого генно-инженерного томата, устойчивого к хранению – Flavr Savr. Как и ожидалось, подавление PG с использованием подхода интерферирующей РНК привело к уменьшению солюбилизации пектина клеточной стенки и увеличению срока годности томатов [1, 2]. Сегодня, главным образом, результаты работ, проведенных с применением интерферирующей РНК, проводятся с целью обнаружения целевых генов для применения куда более совершенной технологии, способной эффективно модифицировать растение томата, не неся в себе недостатков ГМО.

Наиболее совершенный биотехнологический подход для повышения качества плодов томата был разработан на основе геномного редактирования, позволяющего производить сайт-специфические модификации целевых участков ДНК при помощи запрограммированных нуклеаз, которые специфично вносят двухнитевой разрыв в таргетную область генома.

Внутри данного направления было разработано и сконструировано четыре типа нуклеаз: нуклеазы цинкового пальца (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), кластеризованных регулярно расположенных коротких палиндромных повторов, ассоциированных с нуклеазами Cas9 (CRISPR-Cas9) и самонаводящихся эндонуклеаз (Homing endonucleases) [3], способных узнавать крупные участки ДНК длиной до 20 пар оснований. Принципиально важно понимать, что технология геномного редактирования позволяет проводить точную селекцию и может быстро производить новые и свободные от трансгенов растения, которые аналогичны или идентичны растениям, полученным с помощью традиционных методов селекции [5].

Редактирование генома применяется к томатам с 2014 г [7]. Однако лишь некоторые из вышеупомянутых нуклеаз были использованы для улучшения поладив томата. К примеру, при помощи TALEN ученые смогли модифицировать геном томата, вызвав целенаправленную вставку промотора 35S вируса мозаики цветной капусты перед геном биосинтеза антоцианов ANT1, путем гомологичной рекомбинации [4]. Но данная технология состояла из слишком громоздкой аминокислотной конструкции, которая затрудняла эффективную доставку в клетки растений и животных. Поэтому ей на смену пришла технология, которая оказала огромное влияние на всю биотехнологию, генерируя огромное количество научных статей каждый год.

Системы CRISPR/Cas9 – это системы редактирования генома третьего поколения, которые появились в 2012 году и быстро вытеснили ZFN и TALEN благодаря своей большей простоте и удобству использования [6]. Первоначально CRISPR/Cas был идентифицирован как эффективная приобретенная иммунная система бактерий против вирусной инфекции, которая основана на комплементарном взаимодействии РНК-ДНК, обуславливая нацеливание геномного редактирования на целевой участок ДНК. Данная система редактирования может работать двумя способами. Самый простой из них это double-strand breaks (DSBs) или двуцепочечный разрыв, который восстанавливается гомологичным сшиванием концов ДНК, приводя к потере участка цепи, находившегося между двумя разрывами [8]. Эта технология нокдауна генов. Но CRISPR предоставляет и более перспективную возможность, известную как homology-directed repair (HDR), которая позволяет производить вставку заданной цепи ДНК в определенном месте генома за счет негомологичного соединения концов (NHEJ). Это позволяет осуществлять трансгеноз новых генов и изменять аллели уже имеющихся, меняя свойство генов, а не просто выключая их. Для подхода HDR наиболее эффективной зарекомендовала себя комбинация известная как CRISPR/Cpf1 [9]. Также разработано множество дополнительных модификаций, сопутствующих применению технологии CRISPR в томате. К примеру, добавление экспрессионной кассеты для сверхэкспрессии антоцианового интенсифицирующего гена PAP1/MYB75 в конструкцию CRISPR/Cas9 ускоряет производство не ГМО растений, которые можно визуально отличить по цвету [10]. Или использование наночастиц, несущих на своей поверхности конструкции CRISPR/Cas9, которыми достаточно опрыскать листья томата для того, чтобы произошло редактирование. CRISPR применялся для модификации показателей качества плодов томата, таких как окраска. CRISPR/Cas9 целенаправленное разрушение гена томата MYB12, который является основным регулятором биосинтеза флавоноидов, в красных томатах привело к появлению розовой окраски плодов [11]. CRISPR/Cas9 нокаут генов каротиноидизомеразы (CRTISO) и фитоенсинтазы 1 (PSY1) в пути биосинтеза каротиноидов приводил к оранжевым и желтым плодам томата, соответственно [12]. На рынке есть и томаты, созданные путем CRISPR модификации генов антоцианов, такие как «Sun Black» [13]. Кроме окраски, ученые использовали CRISPR для повышения питательной ценности плодов.

К примеру, мультиплексное CRISPR-редактирование пяти генов, связанных с каротиноидным метаболическим путем томата, включая Stay-Green 1 (SGR1), ликопин ɛ-циклазу (LCY-E), бета-ликопинциклазу (Blc), ликопин β-циклазу 1 (LCY-B1) и LCY-B2, привело к тому, что содержание ликопина в плодах томата увеличилось примерно в 5,1 раза [14]. Еще мультиплексная панель CRISPR была использована для повышения уровня гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), которая является небелковой аминокислотой, используемой нашим организмом как тормозящий нейротрансмиттер, который ингибирует нервный импульс. В результате редактирования трех генов GABA-T, CAT9 и SSADH удалось повысить ее содержание от 1,34 до 3,50 раз [15]. Также модификация томата проводилась в направлении создания бессемянных плодов. Известно, что партенокарпия контролируется несколькими фитогормонами, особенно ауксином [16]. Опосредованные CRISPR Cas9 мутации гена SlIAA9, кодирующего ауксин/индол-3-уксусную кислоту (Aux IAA), и двух генов, кодирующих фактор транскрипции AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF), включая SlARF7 и SlARF5, приводили к образованию бессемянных плодов томата [17]. Эти результаты еще раз подтверждают значимость ауксина в формировании семян в плодах томата. Лежкость также является важным компонентом качества плодов. CRISPR-направленный мутагенез и замена гена ALC у томата, идентифицированного из спонтанного мутанта томата alcobaca (alc), значительно увеличил продолжительность хранения плодов [18]. Подобных показателей лежкости удалось добиться, путем внесения мутации в ген PL, модифицирующий клеточную стенку томата [19].

Технология CRISPR действительно позволила произвести революцию в биотехнологии и селекции томата, в частности. Однако уже сейчас разрабатываются новые подходы, которые, пока что остаются в тени.

Это митохондриально-направленные эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (mitoTALEN) [20], позволяющие изменять ДНК в митохондриях, где содержится много потенциально значимых для селекции генов; системы делеции, индуцированные слиянием APOBEC-Cas9 (AFID) [21], которая вырезает большие куски ДНК, эффективно выключая гены из транскрипции; и системы Prime редактирования [22], которые позволяют точно производить редактирование по типу HDR с повышенной частотой событий.

Системы CRISPR/Cas9 — это системы редактирования генома третьего поколения, которые появились в 2012 году и быстро вытеснили ZFN и TALEN благодаря своей большей простоте и удобству использования. Первоначально CRISPR/Cas был идентифицирован как эффективная приобретенная иммунная система бактерий против вирусной инфекции, которая основана на комплементарном взаимодействии РНК-ДНК, обуславливая нацеливание геномного редактирования на целевой участок ДНК.

Авторы:

М.В. Будылин, к.б.н., заведующий лабораторией молекулярной диагностики "ГАВРИШ", Д.Ю. Тяпкина, к.б.н., А.А. Даниленко, м.н.с.

Литература:

Kramer MG, Redenbaugh K (1994) Commercialization of a tomato with an antisense polygalacturonase gene: the FLAVR SAVR™ tomato story. Euphytica 79:293–297. https://doi.org/10.1007/BF00022530
Smith CJ, Watson CF, Morris PC et al (1990) Inheritance and effect on ripening of antisense polygalacturonase genes in transgenic tomatoes. Plant Mol Biol 14:369–379. https://doi.org/10.1007/BF00028773
Chen K, Gao C (2014) Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements. Plant Cell Rep 33:575–583. https://doi.org/10.1534/g3.113.007104
Čermák T, Baltes NJ, Čegan R et al (2015) High-frequency, Precise modification of the tomato genome. Genome Biol 16:232.
https://doi.org/10.1111/pbi.12370.30
Araki M, Ishii T (2015) Towards social acceptance of plant breeding by genome editing. Trends Plant Sci 20:145–149
Zhang Y, Massel K, Godwin ID, Gao CX (2018) Applications and potential of genome editing in crop improvement. Genome Biol 19:210
Brooks C, Nekrasov V, Lippman ZB, Van Eck J (2014) Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system. Plant Physiol 166:1292–1297
Xu JM, Hua K, Lang ZB (2019) Genome editing for horticultural crop improvement. Hortic Res 6:113
Vu TV, Sivankalyani V, Kim EJ, Doan DTH, Tran MT, Kim J, Sung YW, Park M, Kang YJ, Kim JY (2020) Highly efficient homology-directed repair using CRISPR/Cpf1-geminiviral replicon in tomato. Plant Biotechnol J 18:2133–2143
Hu N, Xian ZQ, Li N, Liu YD, Huang W, Yan F, Su DD, Chen JX, Li ZG (2019) Rapid and user-friendly open-source CRISPR/Cas9 system for single- or multi-site editing of tomato genome. Hortic Res 6:7
Deng L, Wang H, Sun CL, Li Q, Jiang HL, Du MM, Li CB, Li CY (2018) Efficient generation of pink-fruited tomatoes using CRISPR/Cas9 system. J Genet Genomics 45:51–54
Dahan-Meir T, Filler-Hayut S, Melamed-Bessudo C, Bocobza S, Czosnek H, Aharoni A, Levy AA (2018) Efficient in planta gene targeting in tomato using geminiviral replicons and the CRISPR/Cas9 system. Plant J 95:5–16
Blando F, Berland H, Maiorano G, Durante M, Mazzucato A, Picarella ME, Nicoletti I, Gerardi C, Mita G, Andersen OM (2019) Nutraceutical characterization of anthocyanin-rich fruits produced by “Sun Black” tomato line. Front Nut 6:133
Li XD, Wang YN, Chen S, Tian HQ, Fu DQ, Zhu BZ, Luo YB, Zhu HL (2018d) Lycopene is enriched in tomato fruit by CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing. Front Plant Sci 9:559
Li R, Li R, Li XD, Fu DQ, Zhu BZ, Tian HQ, Luo YB, Zhu HL (2018a) Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum. Plant Biotechnol J 16:415–427