Получение гибридов лука репчатого на основе удвоенных гаплоидов

У лука репчатого при получении линий путем самоопыления проявляется сильная инбредная депрессия.

Даже при 2-3 самоопылениях подряд наблюдается существенное снижение урожайности, массы луковицы и т. д. Один из путей решения этой проблемы - технология получения удвоенных гаплоидов, так как полученные линии при этом имеют высокую генетическую однородность за счет полной гомозиготности всех генов. Другое преимущество применения данной технологии - существенное сокращение времени, необходимого для создания родительских линий. Из-за того что лук - двулетняя культура, требуется не менее 10 лет для создания гомозиготной линии путем инбридинга. При применении технологии удвоенных гаплоидов этот срок сокращается до 2 лет, или в 5-6 раз.

Материалы и методы исследований

Удвоенные гаплоиды (DH-растения) лука репчатого были получены методом культуры семяпочек на базе лаборатории биотехнологии Селекционного центра «Гавриш» с использованием усовершенствованной в центре технологии на основе методических рекомендаций С.Г. Монахосаидр. (2014). DH-растения лука репчатого с развитой корневой системой и листовым аппаратом были высажены в открытый грунт и выращены по общепринятым для зоны технологиям на участках Селекционного центра «Гавриш» (Крымск, Краснодарский край).

Результаты исследований, получение DH-растений

В лаборатории биотехнологии Селекционного центра «Гавриш» были получены удвоенные гаплоиды лука репчатого методом культуры семяпочек, основные этапы которого схематично представлены на рисунке 1. Для их создания были подобраны 27 наиболее ценных селекционных образцов, которые, по данным лаборатории биотехнологии, отличались отзывчивостью к эмбриогенезу.

Всего в лаборатории биотехнологии было получено 162 эмбриоида (0,6% от общего числа бутонов в 28 тыс. шт.), из которых 59 растений (36% от числа эмбриоидов) после обработки колхицином и пересадки в грунт сформировали развитую корневую систему и листовой аппарат. Анализ плоидности методом проточной цитометрии показал, что среди полученных растений только 40 — удвоенные гаплоиды, остальные — гаплоиды или миксоплоиды. Выделенные DH-растения были переданы в лабораторию луковых культур для включения в селекционный процесс и получения семенного потомства.

Выращивание DH-растений и структура полученных луковиц на разных стадиях развития

Для дальнейшего роста и развития полученные DH-растения лука репчатого выращивали в открытом грунте. Во время всего периода выращивания (от севка до цветения) проводили стандартные технологические мероприятия: полив, подкормку минеральными удобрениями, рыхление, прополку, обработку инсектицидами и фунгицидами. Из 40 высаженных DH-растений после хранения, яровизации и отбора получено 3 маточных луковицы: DH-растение-1, DH-растение-3, полученные из образца Эленка, и DH-растение-6, полученное из образца Супернова (рис. 2).

Развитие семенных DH-растений и их опыляющая способность

В апреле 2021 года отобранные маточные луковицы были высажены для получения инбредных семян и опыления со стерильной линией. Для обеспечения целостности луковиц ПЦР-анализ для выявления генотипа по признаку ЦМС был проведен на зеленых листьях, перед цветением. В результате анализа у выделенных DH-растений были выявлены следующие генотипы: N/MsMs (DH-растение-1), N/msms (DH-растение-3) и S/MsMs (DH-растение-6), которые должны обеспечивать фертильность растений. При этом DH-растение-3, имеющее генотип N/msms, может представлять интерес как закрепитель стерильности и как опылитель, так как при скрещивании со стерильной материнской формой даст стерильный гибрид и тем самым позволяет защитить авторские права селекционера. Другие DH-растения могут быть использованы при создании отцовских линий-опылителей для гибридов лука репчатого, так как их инбредное потомство должно быть выровнено по морфологическим признакам, в то время как со многими линиями, полученными традиционными методами селекции, требуется еще провести как минимум 2 поколения инбридинга для достижения константности материала.

В мае 2021 года у полученных линий началось формирование стрелки (рис. 3), а в июне — цветение.

DH-растение-1 и DH-растение-6 сформировали цветоносы и семена, тогда как у DH-растения-3 образовались редуцированные бутоны, которые не образовывали пыльцу. Поэтому инбридинг и гибридизация со стерильными формами были проведены только с участием двух фертильных DH-растений-1 и -6, которые относятся к разным генотипам. В качестве материнских форм при скрещивании с DH-растениями были подобраны перспективные стерильные линии, раннее полученные в лаборатории селекции луковых культур, ВС (Катанка х Эленка) и ВЦ (Бенефит х Леон) (табл. 1).

Бридную комбинацию был надет изолятор, внутрь которого для улучшения качества опыления были помещены куколки мух, применение которых гораздо эффективнее ручного опыления с помощью перьевых кисточек. Во избежание смешивания семян после завершения цветения стерильное растение и DH-растение (опылитель) были разделены, и на каждое был надет изолятор для дальнейшего созревания семян. Через 2 месяца были получены семенные потомства от гибридных комбинаций (F1) и инбридинга (Ro), таблица 2.

Несмотря на высокие температуры и влажность воздуха, в гибридной комбинации F1 (ВЦ (Бенефит х Леон) х Эленка) получено 68 семян, чего достаточно для последующего изучения. У гибрида F1 (ВЦ (Катинка х Эленка) х Супернова) получено 677 семян, что почти в 10 раз больше, чем у первого гибрида. Среди опылителей DH-растение-6 Супернова также лидер и более чем в 2,5 раза превысило завязываемость DH-растения-1 по числу семян. Это характеризует его как хороший опылитель, который, помимо нужного генотипа, имеет достаточное количество пыльцы для опыления стерильных материнских форм и хорошую завязываемость семян у получаемых гибридов F1.

Таким образом, из 40 DH-растений лука репчатого, полученных в лаборатории биотехнологии и относящихся к 7 генотипам: Спрингджой, Цефей, Полаке, Галилео, Эленка, Супернова, Дерек, в результате роста, развития, хранения, яровизации и цветения получено семенное потомство только от маточных луковиц двух DH-растений, которые относятся к двум генотипам: Эленка и Супернова. 

Такой невысокий выход конечной продукции обусловлен самой природой удвоенных гаплоидов: при общем количестве генов лука более 27 000 создание гомозиготной линии, полностью лишенной летальных и полулетальных аллелей, происходит с частотой менее чем 1/5000.

Весной 2022 года полученные гибридные комбинации и инбредные потомства линий-опылителей были высажены через рассаду в открытый грунт и в данный момент начинают формировать луковицу (рис. 4). После полного созревания растений будут проведены сравнительные испытания (определены показатели: урожайность, масса луковицы, окраска и толщина сухих чешуй, степень сохранности), по результатам которых будет принято решение о целесообразности дальнейшего размножения и использования данных DH-линий в селекционной работе и создании гибридов лука репчатого.

Елена Чередниченко, научный сотрудник лаборатории луковых культур ООО «Семеновод», Александр Фёдорович Першин, к. б. н., завлабораторией биотехнологии ООО «Семеновод», Михаил Вячеславович Будылин, к. б. н., замдиректора по молекулярной диагностике и биотехнологии ООО «НИИСОК»

Фото Елена Чередниченко

Наша справка

Гаплоид - организм, имеющий одинарный набор хромосом, в отличие от обычного диплоидного организма с двойным набором хромосом.

Гомозиготная линия - однородная, выровненная по морфологическим признакам линия, при скрещивании с которой не происходит расщепления признаков. Подавляющее большинство ее аллелей находится в гомозиготном состоянии.

Инбредная депрессия - снижение жизнеспособности растений, выражается в уменьшении массы луковицы, урожайности и т. д. происходит вследствие инбридинга и обусловлена гомозиготным состоянием неблагоприятных рецессивных аллелей.

Инбридинг - самоопыление растений, применяется для создания выровненных линий по большинству признаков. Полученные линии используются для создания гибридов.

DH-линия - линия, полученная путем удвоения хромосом у гаплоидных растений, которые, в свою очередь, получены с помощью биотехнологических методов.

DH-растения, или удвоенные гаплоиды, - гомозиготные растения, имеющие удвоенный гаплоидный набор хромосом.

Закрепитель стерильности - линия, имеющая определенный генотип: нормальную цитоплазму (N-цитоплазма) и ядерные гены в гомозиготном рецессивном состоянии (msms), необходим для размножения стерильной линии.

Метод культуры семяпочек - культивирование незрелых семяпочек на искусственных питательных средах in vitro.

Миксоплоид - растение, клетки которого имеют различное число хромосом неполного набора (в основном больше гаплоидного и меньше диплоидного).

Плоидность - число полных наборов хромосом в клетке.

Проточная цитометрия - метод, позволяющий определить плоидность растений благодаря цитометрическому анализу содержания ДНК в каждой клетке, основанному на флуоресцентном окрашивании ядер растений-регенерантов.

ЦМС - цитоплазматическая мужская стерильность, при которой растение имеет стерильную пыльцу, неспособную давать потомство.

Эмбриогенез - физиологический процесс, в ходе которого происходит образование и развитие эмбриоида.

Эмбриоид - зародыш, развивающийся из зиготы.

Яровизация - процесс заложения генеративных органов у озимых, двулетних и многолетних культур для последующего цветения и образования семян. Происходит при температуре 5-10 °C.